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生化分析仪器一般工作流程

生化分析仪的正确应用,只是掌握了测定技术原理还不够,还需要对具体仪器的工作流程及测定计算方法有足够的了解。   

(一)一般工作流程

工作流程可以通过仪器的测定周期来考察。重点关注比色杯空白读数点(CB)、加样品点(S)、各试剂加液点(R1、R2、……)、试剂空白读数点(RB)、各测定读数点(P)、各点时间间隔及周期总时间等。每个仪器一般都在反应转盘的固定位置和反应测定周期的固定时间设置样品试剂和稀释的加液位,以及测定读数点。如HITACHI 7170在P1到P34周期为10分钟时,PO前加样品,Rl在Pl前,R2在P5和P6间,R3在P16和P17间,R4在:P33和P34间。

(二)数据处理计算方法

仪器在各个吸光度读数点读取的吸光度数据,并不一定都纳人浓度计算。仪器往往根据仪器定义和操作者设定的要求,对吸光度原始数据作计算处理,转换成所谓反应数据,再按系数或公式作浓度计算。举例如下:

1.HITACH 7170的终点法测定点(A )吸光度计算为(AX+AX-1)/2。实际吸光度=吸光度数据×10 000。

2.0LYHPUS AU 600试剂空白数据:P0点试剂空白(RB)=P0点吸光度一比色杯水空白(wB);任一测定点试剂空白(RB )。该点吸光度一比色杯水空白(WB)。

3.Monarch 1 000两点终点法的反应数据。(终点测定吸光度一终点空白吸光度)一(始点测定吸光度一始点空白吸光度)。

4.AU 600的终点法(带试剂空白,END法)的反应数据=终点吸光度一P0点吸光度(试剂空白,RB)。终点法(不带试剂空白,END).法)的反应数据=终点吸光度-比色杯水空白(WB)。

5.Au 600的两点法(自身空白)的反应数据=[加第二试剂后测定点读数一P0点读数]一[加第二试剂前测定点读数一PO点读数]。

三、主要操作程序

(一)仪器运行前操作程序

主要进行仪器的基本设置:

l.试验项目设置对试验名称、编码,试验组合(Profile)、试验轮次(Round),必要时包括试验顺序等设置。  

2.各试验的参数设置包括试验间比值、结果核对等参数的设定。

3.剂设置根据有关试验参数,设置各试验的试剂位、试剂瓶规格,必要时设定试剂批号、失效期等。

4.校准品设置对校准品的位置、浓度和数量等进行设置。

5.质控设置 根据质控要求。设置质控物个数,质控规则,质控项目及相应质控参数等。

6.样品管设置 包括样品管类型,残留液高度(死体积),识别方式等设置。

7.其他设置对数据传输方式、结果报告格式、复查方式及复查标准等设置。

(二)常规操作程序

开机(预热、保养)-设置开始条件(日期时间索引、轮次、样品起始号等)-根据需要,申请校准、质控和病人测定项目(包括架号、杯号或顺序号。测定中可继续申请)_装载校准品、质控物和病人标本-装载试剂-核对仪器起始状态(未应用条码系统,采用顺序识别样品时,尤其要核对测定起始编号是否与样品架号和申请号相符)-定标和质控测定-检查定标和质控结果-病人标本测定-测定过程监控(试剂检查,观察分析结果,编辑校正)-数据传递(打印报告,向检验管理系统传输,包括工作量统计、财务统计、病人情况追踪、质控分析等)。测定后保养。

(三)测定结果检查分析

1.要了解和熟悉仪器的各种警示符号的含义与作用在正确设定参数的前提下,利用各种警示符能提高我们发现问题和解决问题的效率。

2.要熟悉和灵活运用仪器的相关操作屏(界面) 如:用反应过程监测(Reaction Monitor),观察反应时间进程曲线;用校准追踪(Calibration Trace)回顾分析校准曲线;利用统计(Statistics)了解不同日期段病人测定均值及数据分析;运用分析数据编辑(Data Edit)察看和校正测定数据。

3.校准的检查要充分利用仪器设置的功能,监测校准曲线图形、各校准点吸光度值(不能忽略试剂空白值及空白速率值)、计算K值等的波动情况,以及与以往的比较。必要时,应进一步检查反应时间进程曲线。必须结合质控数据来把握实验条件。

4.病人结果的检查除了目测观察或用血清指数了解标本性状,注意和了解临床资料及诊断外,学会分析反应时间进程曲线及数据是重要的基本功。

四、基本测定方法   

(一)终点法(End point method)   

根据反应达到平衡时反应产物的吸收光谱特征及其吸光度大小,对物质进行定量分析的方法。对一般化学反应来说,反应完全(或正、逆反应动态平衡)、反应产物稳定时为反应终点。对抗原一抗体反应来说,是抗原和抗体完全反应、形成最大且稳定的免疫复合物时为终点。在反应时间进程曲线上为与x轴平行线区段。在测定计算方式上,一般分为一点法和两点法两种。

1.一点法(One Point) 以试剂和样品混合之前的空气空白(GB)、水空白(WB)或试剂空白(RB)的吸光度值为测定计算基点,以反应终点的吸光度读数减去空白读数,得到反应吸光度。通过与相同条件下校准液反应吸光度的比较,求得测定结果。常与一点校准法配合使用,即采用一个校准浓度,校准曲线通过零点且成线性。也应用多点校准。

2.两点终点法(Two Point End)即终点一始点法 以试剂和样品混合之后的某一时间点作为始点,以反应终点的吸光度读数减去始点读数。一定条件下可降低样品对反应或反应本身的特异性于扰(主要指色度干扰)。常采用双试剂,多以加R2前某一点作测定始点;某些情况下,也可以加R2后一点作测定始点。若使用单试剂,主反应启动太快或仪器起始读数点受限时难以运用。

固定时间法(Fixed Method)与两点终点法的区别只是在:测定读数的末点不在反应平衡区段,而是根据方法学选择。如血清肌酐(苦味酸法)测定。

3.三点终点法 即双终点法,在一个通道内一次进行两项反应相关的终点法测定。比如同测游离脂肪酸和甘油三酯。某些仪器(如HITACHI系列)设置此方法。

(二)连续监测法(Continuous monitoring method)

又称速率法(Rate Assay)。即连续监测反应过程,根据所测定的产物生成或底物消耗的速度进行定量分析的方法。在反应时间进程曲线上为反应呈恒速区段(斜率保持不变),常用于酶活性线性反应期测定。

1.连续监测法即零级反应速率法,亦称斜率法。在较长的反应时间区段内(至少90-120秒),每隔一定时间(常为2~30秒)读取一次吸光度值,至少读取4点,得到3个△A;一般将连续多次读数作最小二乘法处理,读数间隔时间太短的作带速率时间(TR)多点法处理,均取线性反应部分的读数,求出单位时间内的反应速率△A/min。此法必须以零级反应为测定计算的基础,因为只有在零级反应下,单位时间内的吸光度变化(反应速率△A/min)才与酶活力呈正比。此法相对减少了分析误差,大大提高了分析速度和准确性。但是,半自动生化分析仪采用单样品连续监测,相当耗时。应用连续监测法,首先应准备线性范围内的高、中、低浓度的样品,分别作反应时间进程曲线,了解不同浓度下反应全过程,兼顾确定延迟时间和线性监测期。

2.两点速率法即所谓拟一级速率法。在反应中选取两时问点t 1、t 2,读取吸光度A 1、A2,计算(A2-A1),(t2-t1)=△A,△t。此方法与终点两点法的区别主要有两点:后一读数点反应未达终点,以速率计算结果。它与连续监测法比较,缺点在于人为确定t 1、t 2,不定因素较多,不能保证反应在t 1-t 2期间呈线性,影响结果准确性;应在常规测定前,先做预试验来确定线性时间段。若在选择的时间段内反应不成线性(如零级反应期短,仪器无法设置或测定),则只能改用终点法。优点在于方法简单;酶活力较低、测定吸光度值较小时,可增加测定时间段而不受仪器连续监测时间点的局限,减少读数误差。

3.速率B法在一个通道内一次进行两项反应相关的速率法测定。它既可以是两项试验测定,也可用于干扰或/及样品空白自动补偿0后一用途的原理是:利用仪器的微机自动处理,在第一反应(干扰反应)一直维持线性的前提下,可以从第二反应(主反应)速率中扣除第一反应速率的延续影响。如用于消除胆红素转化为胆绿素吸光度下降、对肌酐苦味酸法测定的负干扰等。某些仪器(如HITACHI系列)设置此方法。

(三)空白(blank)校正

在分光光度法中,常利用空白溶液来调节仪器的吸光度零点,或用来抵消某些测定的干扰因素。在生化分析仪测定中,除了采用双或多波长、两点法等排除背景干扰外,常要运用专门空白测定,以便从样品测定吸光度中扣除其影响。正确选择空白校正,对提高准确度起重要作用。

1.试剂空白一般在方法类型和校准模式中,即分为有或无试剂空白两大类。试剂空白单独测定或与校准配合测定,并需预选装载去离子水样品杯或试剂空白架。校准或病人样品的各测定点吸光度,均要扣除相应测定点的试剂空白吸光度或空白速率值。无试剂空白的方法,多直接以反应杯的水空白作为测定基准值。

在不少仪器中,试剂空白测定类似校准测定,并非在病人样品测定时实时测定。所以,要注意它的测定频率,避免因试剂批号或质量的变化造成试剂空白的改变引起的计算误差。

2.样品空白 主要为了消除样品本身混浊或色度的干扰。常采用空白通道法,测定校正结果=显色反应通道结果-空白通道结果。多数仪器须另外占用测定通道,分析速度减半,但去干扰的准确性应高于两点终点

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